序言：作為思想的載體和知識的探索者，寫作是一種獨特的藝術(shù)，我們?yōu)槟鷾?zhǔn)備了不同風(fēng)格的5篇分子生物學(xué)進(jìn)展，期待它們能激發(fā)您的靈感。

篇1

關(guān)鍵詞禽流感病毒;基因組;變異性;分子診斷;研究進(jìn)展

中圖分類號 R51 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0216-02

禽流感(Avian influenza,AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性傳染病,國際獸疫局(OIE)把該病定為A類烈性傳染病。禽流感病毒(Avian influenza vi- rus,AIV)典型的病毒粒子為球形,直徑80～120nm,有時呈絲狀體等多形態(tài),至今A型流感病毒的血凝素已發(fā)現(xiàn)有16種,神經(jīng)氨酸酶有10種。其血清型較多,容易變異。常發(fā)生在禽,有時也發(fā)生在低等哺乳類動物,至今在人僅有偶發(fā)病例。禽流感病毒根據(jù)其對雞致病性的不同分為高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不僅會給養(yǎng)禽、畜牧業(yè)帶來災(zāi)難性的破壞,而且對公共健康也構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

1AIV基因組及其編碼蛋白的功能

1.1AIV基因組

AIV基因組為單股負(fù)鏈RNA,共有8個獨立的RNA節(jié)段。通過對某些毒株8個節(jié)段的測序,發(fā)現(xiàn)它們存在一些共同的特點,即所有基因節(jié)段的5′端前13個核苷酸均相同,3′端也有12個高度保守的核苷酸,另外在每一節(jié)段靠近5′端15～21位核苷酸處有一保守區(qū)。其序列為PolyU。這一序列可以在病毒mRNA合成時產(chǎn)生PolyA。

1.2病毒的蛋白

1.2.1血凝素(Hem agglutinin,HA)。HA是流感病毒囊膜纖突的主要成分之一,是基因表達(dá)產(chǎn)物中最大的糖蛋白,為誘生保護(hù)性免疫的主要抗原,HA在病毒吸附及穿膜過程中起關(guān)鍵作用,刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體,可中和病毒的感染力,抵抗病毒的感染和發(fā)病。它是A型流感病毒毒力的主要決定因素。

1.2.2神經(jīng)氨酸酶(Heuram in idase,NA)。NA由病毒核糖核酸(vRNA)片段6編碼,是另一個主要的表面抗原,其成熟的形式是具有催化活性的四聚體,能將唾液酸從糖蛋白和糖脂中切開。其作用是水解細(xì)胞表面的特異性糖蛋白末端的N―乙酰基神經(jīng)氨酸。避免病毒粒子的聚集,有利于病毒的釋放,對病毒在感染細(xì)胞周圍的擴(kuò)散能力有很大影響。

1.2.3白(Nucleo protein,NP)。NP是由片段5編碼的結(jié)構(gòu)蛋白。主要功能是使病毒RNA(vRNA)形成核糖白復(fù)合體,以此來穩(wěn)定vRNA,使其免受核糖核酸作用。另外,NP在病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制以及決定病毒的宿主特異性方面都有重要的作用,而且它是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞識別的主要抗原。

1.2.4基質(zhì)蛋白(Matrix protein,MP)。第7節(jié)段RNA編碼的蛋白被稱為M1,部分分子量較小的蛋白稱為M2。M1構(gòu)成病毒的基質(zhì)膜,具有型特異性,其抗原性的差異也是流感病毒分型的依據(jù)之一。另外,M1在子代病毒粒子的裝配方面也有一定的作用。M2是一種跨膜蛋白,其作用是在HA合成過程中作為離子通道控制高爾基體內(nèi)的pH值,在病毒脫殼時酸化病毒粒子的內(nèi)部環(huán)境。

1.2.5聚合酶蛋白(PB1、PB2、PA)。A型流感病毒的聚合酶蛋白由PB1、PB2、PA等3種成分組成。這3種蛋白質(zhì)的共同特點是含有一特異的親核序列區(qū),其作用是使這幾種蛋白質(zhì)在胞漿合成后能順利進(jìn)入細(xì)胞核。其中,PB2、PB1與合成互補RNA有關(guān),而PA、白與病毒的RNA合成有關(guān)。

1.2.6非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural proteins,NS)。A型流感病毒的結(jié)構(gòu)蛋白由片段8編碼。片段8也有2個編碼框,可編碼2種蛋白質(zhì)即NS1和NS2。NS1和NS2 兩種非結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)是基因組中最小的RN段。NS1和NS2相互間有70個氮基酸重疊,分別由不同的mRNA翻譯,提示它們由不同讀碼框架翻譯。在早期感染中NS1合成并在細(xì)胞核內(nèi)積聚,磷酸化的NS1蛋白在病毒的復(fù)制過程中起調(diào)節(jié)作用;NS2主要在晚期感染中出現(xiàn),并主要在胞漿中存在,目前它的功能還沒有徹底搞清。

1.2.7其他蛋白質(zhì)(HE、M3、NB)。由基因節(jié)段7編碼,明確的功能還不清楚。

1.3AIV毒力變異的分子基礎(chǔ)

AIV很容易發(fā)生變異,誘發(fā)AIV發(fā)生變異的主要機(jī)理有抗原性變異,即抗原漂移(Antigenic Drift)和抗原轉(zhuǎn)變(Antigenic Shift)。在甲型流感病毒中,抗原漂移主要是由HA或NA基因發(fā)生點突變引起的,其中HA基因的變異率最高。每個核苷酸在每個復(fù)制周期中的變異率可高達(dá)2.0%。一般認(rèn)為,來自宿主的免疫壓力是HA和NA抗原漂移的主要原因。由于突變幅度較大或各節(jié)段RNA間發(fā)生的重排導(dǎo)致抗原性發(fā)生大轉(zhuǎn)變導(dǎo)致新病毒亞型的產(chǎn)生,這種變異稱為抗原轉(zhuǎn)變。大量試驗證明,不同亞型病毒同時感染1個細(xì)胞時,病毒基因組可發(fā)生節(jié)段間的交換。理論上講,8個RN段存在256個不同的組合方式。事實證明,在自然界中經(jīng)常有混合感染導(dǎo)致基因重組的事件發(fā)生。

2AIV的分子診斷

2.1血清學(xué)診斷技術(shù)

血清學(xué)診斷技術(shù)是從禽類體內(nèi)采集血液析出血清后,檢測血清中抗體的有無和滴度變化,如瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(AGID)、細(xì)胞凝集抑制試驗(HI)。AGP試驗鑒定病毒或檢測特異性的血清抗體或基質(zhì)蛋白MP(Matrix protein)、特異性白NP。血細(xì)胞凝集試驗(HA)和血細(xì)胞凝集抑制試驗(HIT)鑒定病毒或血清抗體的亞型,神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(NI)鑒定病毒或血清抗體亞型等。

2.2RT-PCR分子診斷技術(shù)

崔尚金等(1998)建立了一種能夠直接檢測禽糞和雞胚尿囊液中H亞型禽流感病毒RNA的RT-PCR檢測方法。檢測過程僅需8h,不僅具有高度的敏感性和特異性,還可大大縮短對禽流感病毒的檢出時間。而應(yīng)用毛細(xì)管PCR(15 min,30個循環(huán))代替常規(guī)PCR(2.5h,30個循環(huán))進(jìn)一步縮短檢測時間的研究也已展開。并進(jìn)入更深層次的領(lǐng)域,以期用于不同樣品的檢測,使該方法更加適用于禽流感病毒的臨床早期診斷。該技術(shù)在特異地檢出H或H亞型禽流感病毒同時,還可根據(jù)應(yīng)用特定引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出的H和H包括裂解位點在內(nèi)的HA基因片段。經(jīng)測序推導(dǎo)出的氨基酸序列,判斷H或H亞型禽流感病毒的致病性高低。

2.3酶免疫測定(EIA)技術(shù)

EIA技術(shù)在AI的診斷與監(jiān)測方面已被廣泛采用。Doller等建立了一種從鼻咽分泌物中直接檢測流感病毒抗原的酶免疫方法,該方法無須對病料進(jìn)行超聲處理,而且在4h即可出結(jié)果。Cherian等建立了一種用于檢測呼吸道分泌物中A型流感病毒RNA的PCR酶免疫(PCREIA)方法。該方法對感染后4d的病料A型AIV的檢測特別有效。Schweiger等建立了用于檢測A型AIVN1和N2型的DNA酶免疫(DEIA)方法。該方法簡單、快速,可進(jìn)行大批樣品的檢測。

2.4熒光PCR法

熒光RT-PCR技術(shù)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的新技術(shù),將熒光素標(biāo)記的探針與引物一起,在熒光PCR儀中反應(yīng),電腦對整個反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)測,避免了交叉污染,提高了檢測敏感性,已成功用于人乙型肝炎病毒、衣原體、艾滋病病毒等的檢測,根據(jù)A型禽流感病毒的共有NP基因序列設(shè)計引物、探針,建立的通用型熒光RT-PCR檢測方法不僅能夠用來檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型,而且對其他禽流感病毒亞型也能檢出。用通用型探針、引物檢測常見其他禽類病毒,未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。說明該方法敏感性高、特異性強(qiáng)。

2.5核酸探針技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是目前生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一,是定性和定量檢測特異性DNA或RNA的有力工具。用PCR技術(shù)制備了白基因片段(NPC)的地高辛標(biāo)記cDNA探針,建立并優(yōu)化了檢測AIV的探針雜交法。該探針具有較好的特異性和敏感性,為從分子水平探討禽流感的發(fā)病機(jī)理和臨床早期快速診斷提供了新的研究手段。對以基因芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒的診斷技術(shù)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,DNA芯片技術(shù)可以提供一種有效的AIV診斷方法。

3結(jié)論

禽流感是一種全球性的烈性傳染病,可在宿主中不斷發(fā)生變異和基因重組,是2l世紀(jì)我國養(yǎng)禽業(yè)將面臨的最大的瘟疫性威脅。禽流感可在禽、豬和人中進(jìn)行傳播。AIV不僅作為人流感的最大基因庫而間接威脅人類健康,而且還可作為人類的新病毒而直接構(gòu)成人類的威脅。因此,預(yù)防禽流感具有重要的公共衛(wèi)生意義和經(jīng)濟(jì)意義。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,以及同其他學(xué)科間的滲透,禽流感的傳統(tǒng)檢測診斷技術(shù)將與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合或者現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與其他學(xué)科研究技術(shù)有機(jī)結(jié)合,一定會實現(xiàn)診斷的快捷、方便、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)、易操作,為禽流感的防治做出重大貢獻(xiàn)。

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篇2

近年來，世界食管癌(esophageal cancer,EC）患者以每年30萬例的速度劇增，這引起國內(nèi)外的普遍關(guān)注。由于食管癌的發(fā)病在分子水平上涉及多類基因及蛋白質(zhì)的作用，故分子生物學(xué)研究對其早期診斷、治療及預(yù)防等有重要意義。本文擬就近年食管癌的分子生物學(xué)研究進(jìn)展做簡要的綜述。

1 生長因子基因

1.1 表皮生長因子受體EGFR：表皮生長因子受體EGFR是分子量170KD的跨膜酪氨酸激酶糖蛋白，由原癌基因erb-4編碼而成，與其配體EGF或TGF-a結(jié)合可激活受體本身的酪氨酸蛋白激酶活性，從而激活信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，刺激細(xì)胞生長增殖。erbB-1（EGFR）、erbB-2(HER2)erbB-3和erbB-4共同構(gòu)成表皮生長因子家族，它們都屬于酪氨酸激酶受體。臨床上在多個食管鱗癌（ESCC）細(xì)胞系及ESCC腫瘤的標(biāo)本中，都發(fā)現(xiàn)過EGFR的過表達(dá)。C-erbB-2編碼蛋白p185與細(xì)胞偽足結(jié)合，能加速細(xì)胞運動，從而促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤與轉(zhuǎn)移。日本、美國和法國的研究資料表明，食管腺癌（EADC）EGFR基因擴(kuò)增率較高（30.8%），并出現(xiàn)EGFR和C-erbB-2基因共擴(kuò)增[1]，ESCC EGFR基因擴(kuò)增率則為8%～30%，且C-erbB-2沒有擴(kuò)增。由此，研究EGFR和C-erbB-2可能與食管癌的發(fā)生有關(guān)，且EGFR可能存在地區(qū)和種族差異性。同時，通過對食管癌前病變的研究，發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白過度表達(dá)在食管基底細(xì)胞過度增生和間變的發(fā)生率分別為39%和80%，而在正常食管黏膜上皮則未見該蛋白過度表達(dá)，因此提示EGFR與EC癌前病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

1.2 血管內(nèi)皮生長因子VEGF：在調(diào)節(jié)控制血管生長的過程中，血管內(nèi)皮生長因子VEGF顯得尤為重要。實驗室中對五個EC細(xì)胞系進(jìn)行RT，PCR技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)其中有四個細(xì)胞系存在VEGF-C mRNA表達(dá)。醫(yī)學(xué)研究表明，約占20%～70%的EC有VEGF的表達(dá)，并且與腫瘤分明、靜脈侵入、EC浸潤深度、淋巴細(xì)胞浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)。

2 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因

2.1 p53基因：p53是一種核轉(zhuǎn)錄因子，是定位于17p13.1上的腫瘤抑制基因，在機(jī)體環(huán)境受到和缺氧、DNA損傷或氧化還原紊亂等刺激時，它可以通過磷酸化和乙酰化作用被激活。p53基因通過p21介導(dǎo)對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，并且通過上調(diào)Bax的同時下凋Bbcl-2來誘導(dǎo)凋亡。p53基因的異常與食管黏膜細(xì)胞癌變的過程密切相關(guān)，大多數(shù)點突變發(fā)生在外顯子5～8之間。Simeda等[2]研究提示，在EC的形成中，p53的基因突變和蛋白產(chǎn)物的聚積先于腫瘤的浸潤，是食管癌發(fā)生過程中一個較早期事件。

同時，研究表明，腫瘤抑制基因p53的突變常伴有pRb的改變。通過對病毒原癌蛋白的研究，提示腫瘤抑制基因pRb和p53有聯(lián)合作用，病毒原癌蛋白能使兩種分子失活。細(xì)胞在一種腫瘤抑制基因異變時,細(xì)胞分裂的加快會加強(qiáng)基因的不穩(wěn)定性,并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞增生調(diào)控紊亂,克隆生長加快,直至形成腫瘤。因此，p53-Rb系統(tǒng)的改變，特別是其對細(xì)胞增生的凋亡調(diào)節(jié)協(xié)同作用紊亂，可能是食管癌變的重要分子機(jī)制[3]。

2.2 pRb基因：Rb基因位于染色體13p14上，具有多個被磷酸化的位點，是多種cyclin-CDK的底物。Rb蛋白通過與E2F的結(jié)合，有效抑制細(xì)胞增生。Cyclin-CDK復(fù)合物可使pRb發(fā)生磷酸化，從而釋放E2F以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄與細(xì)胞分裂。在多種腫瘤及腫瘤細(xì)胞系中，都可發(fā)現(xiàn)pRb基因的缺失或突變，ESCC中，Rb位點LOH在pRb基因的失活中起重要作用。Maesawa等用PCR檢測了49例食管癌Rb位點LOH在pRb基因的失活中起重要作用。Maesawa等用PCR檢測了49例食管癌Rb基因的雜合性丟失（LOH），其LOH的發(fā)生率為52%（13/25）。食管小細(xì)胞中未觀察到pRb的表達(dá)，提示缺乏pRb表達(dá)可能在食管小細(xì)胞癌中起重要作用。

2.3 p16和p15基因：在細(xì)胞周期G1期調(diào)控細(xì)胞增生，錄屬INK4I即cy-clin-dependent kinase 4 inhibitors家族。由于p16和p15基因同時失活可引起pRb調(diào)控的R點（restriction point,G1/S檢驗點）的喪失，因此腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性增生很有可能與p16和p15的失活有關(guān)系。在ESCC細(xì)胞系中55%細(xì)胞系顯示p16,p15和（或）9p21相鄰位點有純合性缺失。在ESCC標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)p16失活占優(yōu)勢作用的是啟動子區(qū)CpG島異常甲基化，突變和純合缺失相對很低，而p15常發(fā)生純合缺失[4]。

2.4 Cyclin D1基因：Cyclin D1位于11q13號染色體上，為正調(diào)控因子。細(xì)胞周期是由CDKs及其亞調(diào)節(jié)單位cyclins序貫性激活調(diào)節(jié)的，通過cyclin D1蛋白來影響CDK介導(dǎo)的Rb磷酸化而促進(jìn)G期細(xì)胞的進(jìn)程，因此cyclin D1蛋白是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白。

Roncallii等發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細(xì)胞癌中，Cyclin D1和Rb蛋白的積聚間，以及p16表達(dá)的缺失和Cyclin D1過度表達(dá)間均存在正相關(guān)有關(guān)系。Cyclin D1在EADC幾乎無擴(kuò)增，而其擴(kuò)增與ESCC有明顯的相關(guān)性[5]。

3 抑制細(xì)胞凋亡基因

3.1 Bc1-2基因：Bc1-2基因?qū)僖种萍?xì)胞凋亡基因，其位于染色體18q21，在正常食管黏膜中不過度表達(dá)。研究表明，Bc1-2基因在ESCC和癌旁非典型增生組織中表達(dá)增高，另外還發(fā)現(xiàn)Bc1-2基因表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)，腫瘤分化程度越高，Bc-2基因陽性表達(dá)率也越高。

3.2 survivin基因：survivin基因?qū)俚蛲鲆种苹颍涞鞍踪|(zhì)表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，在食管癌相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，依正常黏膜――單純增生――不典型增生原位癌――浸潤癌的順序，survivin蛋白表達(dá)的陽性率依次增高[6]。據(jù)此推測，survivin的表達(dá)可能與細(xì)胞生物學(xué)轉(zhuǎn)化的中間環(huán)節(jié)有關(guān)，因而可作為食管癌早期診斷的參考。在形態(tài)學(xué)中若正常及增生黏膜上皮survivin呈陽性表達(dá)時，正常組織中可能存在癌變的可能。在高分化鱗癌中，survivin蛋白表達(dá)低于低分化鱗癌中的表達(dá)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組survivin蛋白表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，據(jù)此推測survivin可抑制食管癌細(xì)胞自身的凋亡過程，使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)無限制生長。

4 代謝酶基因和DNA錯配修復(fù)酶基因

4.1 代謝酶基因：研究發(fā)現(xiàn)，個體對胃腸道腫瘤的易感性可能與前致癌物的激活及解毒間的代謝失衡有關(guān)：化學(xué)致癌物中，絕大多數(shù)為前致癌物，其致癌性需通過Phase-1酶的激化才可發(fā)生作用，而活化的致癌物可被Ph-Ⅱ酶解毒。在對高加索人的研究中發(fā)現(xiàn)，GST第313位核苷酸的堿基替換更常出現(xiàn)于Barrett食管患者和腺癌患者，提示GST可能與個體對Barrett食管和食管腺癌的易感性有關(guān)[7]。而對日本人的研究表明，同時有GST基因和NA12基因者患食管鱗癌的風(fēng)險增加，GST和NAT2的多態(tài)性可能作為一種預(yù)示著對食管鱗癌易感性的遺傳生物標(biāo)記[8]。另外，研究表明細(xì)胞色素P450（CYP）基因?qū)υS多小分子化合物起氧化作用。Nimura等[9]的研究表明具有CYP基因型的重度吸煙者是食管癌高危人群。Lin等[10]報道中國林縣地區(qū)人群的CYP2E1基因Rsal識別的CI基因型頻率在食管癌、食管癌前病變組織比正常對照組高。

4.2 DNA錯配修復(fù)酶基因：由于不同的個體DNA修復(fù)能力也存在著一定的差異，而基因組的不穩(wěn)定性在很大程度上與個體機(jī)能缺乏修復(fù)DNA的能力有關(guān)。DNA修復(fù)能力差的個體突變率高，腫瘤的易感性也相應(yīng)會有所增強(qiáng)。Wang等對中國北部食管癌高發(fā)區(qū)的70個食管癌組織及6個食管癌高危家庭成員進(jìn)行的分析研究，發(fā)現(xiàn)其淋巴細(xì)胞的遺傳呈多態(tài)性，其中7個食管癌標(biāo)本的MGMT中8個密碼子內(nèi)10WH 點突變，而在其鄰近的正常組織未檢測到這些突變。O6-甲基鳥嘌呤-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-methyltrans-ferase,MGMT）可以修復(fù)DNA烷基化試劑引起的突變，分析表明MGMT基因的突變或缺失可能是導(dǎo)致DNA高突變率原因之一[11]。

在外界環(huán)境中，有很多致癌原如亞硝胺等。這些致癌原多為烷基化合物，O6-烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（O6-alkylguanine-DNA alkyhransferase,AGT），是重要的DNA損傷修復(fù)酶，外界環(huán)境中的許多致癌原，包括亞硝胺，許多是可誘導(dǎo)DNA形成O6-烷基鳥嘌呤加成物的烷基化合物。而在保護(hù)細(xì)胞免受烷基化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的突變和細(xì)胞毒侵襲等方面，AGT酶起著重要作用。人的AGT基因共包含5個外顯子以及170多個Kb。AGT基因的編碼序列開始于第二外顯子，其活性位置是第五外顯子145位密碼的半胱氨酸。目前的研究表明，人的AGT基因呈現(xiàn)多態(tài)性。當(dāng)烷基化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA突變前損傷產(chǎn)物O6-烷基鳥嘌呤而又未得到AGT酶的及時修復(fù)時，將促使DNA復(fù)制時發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換，從而增加對腫瘤的易感性，誘導(dǎo)腫瘤形成。實驗已證實在河南食管癌高發(fā)區(qū)人群中，存在AGT第三外顯子84位和第五外顯子第143/178位密碼子多態(tài)變體L2，但AGT多態(tài)變化與食管癌高易感性的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

5 食管癌變分子學(xué)基礎(chǔ)研究的臨床應(yīng)用

近年來，對食管癌分子生物學(xué)研究表明，食管癌是多種相關(guān)或獨立的基因或分子改變的多階段進(jìn)行性演變過程，是多種基因變化累積或綜合作用的結(jié)果。在醫(yī)學(xué)研究中，必須積極尋找、研究食管癌早期基因，并通過分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究來實現(xiàn)食管癌的早期診療和臨床應(yīng)用，這主要包括三個方面：一是根據(jù)分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究，及時對高危人群進(jìn)行檢測，從而選出簡易、經(jīng)濟(jì)、特異性和敏感性高的，作為監(jiān)測所用的生物學(xué)指標(biāo)；二是通過分子生物學(xué)研究，有效提示食管癌的致病因素，以實施有效的食管癌病前預(yù)防、干預(yù)措施；三是充分利用分子生物學(xué)研究結(jié)果，為食管癌患者提供早期診斷指標(biāo)和特異性的生物治療方法，如基因治療法等。

篇3

Abstract: The animal protects own one driving way to ambient temperature's adaptation, displays in the duplication and the expression pattern change of the cell and presents the new gene open and the new protein factor synthesis. The gene level, the protein level, the cell membrane level and so on three aspects has carried on the summary about the research survey of animal which adapts to the ambient temperature, and discussed the molecular biology mechanism as well as in evolution significance which animal adapts to the ambient temperature.

關(guān)鍵詞： 動物；溫度；基因；蛋白質(zhì)；細(xì)胞膜

Key words: animal；temperature；gene；protein；cell membrane

中圖分類號：Q291文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-4311（2011）25-0324-02

0 引言

動物的一切生命活動（生長、發(fā)育和生殖等）都是在一定的環(huán)境溫度中進(jìn)行的。一般說來，變溫動物生長發(fā)育所要求的溫度條件在 6-36℃范圍內(nèi)；恒溫動物由于自身有調(diào)節(jié)體溫的能力，對環(huán)境溫度的適應(yīng)范圍廣些[1]。當(dāng)環(huán)境溫度在最低和最適溫度之間時，動物體內(nèi)的生理生化反應(yīng)會隨著溫度的升高而加快，代謝活動加強(qiáng)，從而加快生長發(fā)育速度；當(dāng)溫度高于最適溫度后，參與生理生化反應(yīng)的酶系統(tǒng)受到影響，代謝活動受阻，勢必影響到動物正常的生長發(fā)育。環(huán)境溫度若超出動物所要求的范圍，動物的生命活動就會出現(xiàn)停滯；溫度過高或過低會導(dǎo)致動物體死亡[2]。近年來關(guān)于動物對外界環(huán)境溫度適應(yīng)的分子生物學(xué)研究主要集中在基因水平、蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞膜水平三個方面。

1 基因水平上的溫度

動物對環(huán)境溫度的適應(yīng)，會使自身的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)模式發(fā)成變化，以適合環(huán)境的變化，此時它會出現(xiàn)新的基因開放和新蛋白因子的合成，這總的來說是動物對自身的一種保護(hù)方式。

外界環(huán)境溫度的改變可以誘導(dǎo)動物體內(nèi)熱激蛋白家族基因的大量表達(dá)，從而調(diào)整動物有機(jī)體對外界環(huán)境溫度的適應(yīng)。

盡管熱激蛋白家族基因序列保守，編碼序列變異較低，但是，由于目前動物種類逐漸增多，熱激蛋白基因序列和拷貝數(shù)等也在逐步顯示出不同的趨勢。

適應(yīng)不同溫度的果蠅居群，其熱激蛋白70基因內(nèi)存在兩個顯著的差異[4]，一個大的插入/缺失（indel）多態(tài)位點（56H8/122）和一個單核苷酸多態(tài)位點差異；對于來自澳大利亞東部不同緯度的11個居群，插入/缺失位點的頻率與緯度呈正相關(guān)，由于緯度與溫度最大（小）值和平均值呈負(fù)相關(guān)，提示溫度和熱值變化可能對Hsp70基因的這一變異頻率產(chǎn)生了影響，Anderson[5]等也發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅3號染色體右臂上hsr-omega基因的8bp缺失作為一個遺傳標(biāo)記與緯度及最高溫（最熱月）呈正相關(guān)，另一個3端重復(fù)的標(biāo)記則多出現(xiàn)于溫帶群體中，與冷適應(yīng)性相關(guān)。適應(yīng)于較低緯度的Drosophila lummei有7個Hsp70基因拷貝，其熱脅迫抗性高于具有5個拷貝的Drosophila lummei，后者在分布上處于較高的緯度，提示Hsp70基因結(jié)構(gòu)與果蠅的適應(yīng)緯度有相關(guān)性[6]。

果蠅體內(nèi)一個名為“DmDG”的基因活性一旦下降，果蠅就會“怕熱”，從而喜歡向溫度更低的地方轉(zhuǎn)移，其喜好的環(huán)境溫度要比正常情況下低5攝氏度[7]。“DmDG”基因可能與果蠅的代謝功能相關(guān)。這個基因活性下降后，果蠅體內(nèi)能量代謝就會活躍，于是就會更喜歡低溫環(huán)境。動物體內(nèi)利用基因調(diào)節(jié)溫度適應(yīng)性的機(jī)制普遍存在，這可以使動物適應(yīng)很大的溫度變化。

克隆斑潛蠅（Liriomyza sativae）3種小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8和Hsp21.7）和2種Hsp60（TCP1α，TCP1ζ），定量PCR分析表明，3種小分子Hsp均能被低溫所誘導(dǎo)表達(dá)，而且Hsp20.8對低溫更敏感，這意味著不同的小分子Hsp可能響應(yīng)不同強(qiáng)度的低溫脅迫。6種Hsp基因（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7、TCP1α、TCP1ζ和Hsp90）的相對表達(dá)量在不同生長發(fā)育階段差異顯著。總的表達(dá)趨勢是：小分子Hsp（Hsp19.5、Hsp20.8、Hsp21.7）在蛹期表達(dá)量最高，而大分子Hsp（TCP1α、TCP1ζ、Hsp90）的表達(dá)量則隨著生長發(fā)育而遞增[8]。這意味著除響應(yīng)溫度脅迫外，熱激蛋白基因可能還在昆蟲的生長發(fā)育中起著一定的作用。

2 蛋白質(zhì)水平上的溫度適應(yīng)

熱激蛋白（Hsps）是生物適應(yīng)環(huán)境溫度變化的一個重要媒介分子。受到熱脅迫刺激后，動物有機(jī)體對熱的脅迫抗性提高與熱激蛋白表達(dá)量普遍成正相關(guān)[9]。

熱激蛋白存在于所有動物細(xì)胞中，是動物受到應(yīng)激原刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組應(yīng)激蛋白，與機(jī)體的應(yīng)激關(guān)系密切，在進(jìn)化上高度保守。對滯育的吉普賽蛾（Lymantria dispar）幼蟲給以37-41℃的熱激可以誘發(fā)合成7種Hsps（分子量分別為90，75，73，60，42，29和22ku），-10--20℃的冷休克導(dǎo)致其產(chǎn)生2種Hsps（90和75ku），當(dāng)在25℃下恢復(fù)時另外又合成分子量29ku的熱激蛋白[10]。斑馬魚在熱脅迫（28-37℃）和冷脅迫（20-28℃）下的熱激蛋白表達(dá)模式存在差異，在熱脅迫條件下，Hsp70呈上調(diào)表達(dá)，而冷脅迫下Hsp70則顯穩(wěn)定表達(dá)[11]。將新月魚的成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)溫度從28℃調(diào)節(jié)到37℃時誘導(dǎo)產(chǎn)生3種不同的熱休克蛋白[12]。

較緩和的高溫對B型煙粉虱Hsp70表達(dá)具有誘導(dǎo)作用，極端高溫會抑制Hsp70表達(dá)。在37-41℃范圍內(nèi)，Hsp70的表達(dá)量隨著溫度的升高而升高，在41℃時達(dá)到最高峰；當(dāng)溫度升高到43℃和45℃，B型煙粉虱Hsp70的表達(dá)量迅速降低。B型煙粉虱溫室種群體內(nèi)的Hsp70表達(dá)量與溫室內(nèi)的溫度有關(guān)：上午到中午隨著氣溫的升高，B型煙粉虱體內(nèi)Hsp70表達(dá)量隨之上升；傍晚氣溫降低時，Hsp70表達(dá)量也隨之下降[13]。Kimura（1998）比較過3個果蠅近緣種熱休克蛋白基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在冷激條件下，亞熱帶低海拔種（Drosophila watanabe）誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)的閾溫度要比溫帶種（D．traurara）和亞熱帶高海拔種（D．trapezifrons）高，而亞熱帶低海拔種的耐寒性卻最低，說明在果蠅中熱休克蛋白基因表達(dá)和耐寒性呈負(fù)相關(guān)[14]。Sorensen et al（2001）研究果蠅（D．huzzatii）不同自然種群間HSP70基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)在冷激下寒溫帶種群誘導(dǎo)熱休克蛋白基因表達(dá)的閾溫度要明顯低于熱帶種群[15]。

3 細(xì)胞膜水平上的溫度適應(yīng)

在正常生理溫度下，細(xì)胞膜的主動運輸、酶的活性、胞外分泌等機(jī)能才能正常進(jìn)行[16]。細(xì)胞的膜脂在不同溫度下具有不同的酰基鏈和鏈長度[16]。細(xì)胞膜化學(xué)成分改變可能是對溫度適應(yīng)的最普遍模式[16]。低溫通過影響細(xì)胞膜的流動性而影響細(xì)胞正常的機(jī)能，對低溫的適應(yīng)不可避免地會涉及到細(xì)胞膜化學(xué)成分的改變。膽固醇能夠促使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的有序化，從而增加細(xì)胞膜的流動性。魚類通過改變脂肪酸中不飽和成分含量和極性磷脂頭部組分，減少細(xì)胞膜中甾醇/磷脂比率來改變膜的流動性使魚類更加適應(yīng)寒冷的外界環(huán)境[17]。通過對不同溫度適應(yīng)下虹鱒魚（rainbow trout）的肝、腎、腮等組織細(xì)胞細(xì)胞膜中膽固醇（C）與磷脂（P）含量的研究發(fā)現(xiàn)，5℃適應(yīng)組細(xì)胞膜的C/P 值顯著低于20℃適應(yīng)組[3]。把魚體暴露于低溫下會導(dǎo)致的極性磷脂中非飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比例增高，有利于在低溫下維持細(xì)胞膜流動性，使魚體更能抵抗低溫?fù)p害[18]。低溫還誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪酸氧化酶的生成，由于它可以提高細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而提高了細(xì)胞膜在低溫條件下的流動性[19]。

在動物對溫度的適應(yīng)過程中，動物細(xì)胞還通過膜上各種離子通道數(shù)量及分布的改變使細(xì)胞內(nèi)離子的成分和濃度發(fā)生相應(yīng)的改變。研究表明，在北極生活的兩種魚類：Trematomus bernacchii和Trematomus newnesi在適應(yīng)較高溫度過程中，腮和腎等滲透壓調(diào)節(jié)器官細(xì)胞膜上的Na/K+-ATP酶活性升高，將細(xì)胞內(nèi)鈉的、氯離子快速泵出體外，從而使得血清中滲透壓明顯降低，與海水間的滲透壓差增大。研究結(jié)果表明，在冷環(huán)境中，魚類靠升高體液離子濃度及滲透壓來縮小與外界海水之間的差異，從而減少能量損耗[3]。鴨子對冷適應(yīng)表現(xiàn)為肌漿網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+-ATPase活性及Ca2+釋放通道數(shù)量上的改變時相與非寒顫產(chǎn)熱的發(fā)生相一致[20]。

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篇4

與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，全文就目前國內(nèi)外對膀胱移行細(xì)胞癌分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究概況作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 膀胱移行細(xì)胞癌　標(biāo)志物　分子生物學(xué)　免疫學(xué)

膀胱移行細(xì)胞癌（TCC）的主要特征有多中心性和易復(fù)發(fā)性，腫瘤細(xì)胞易于種植轉(zhuǎn)移，臨床上僅根據(jù)腫瘤病理判斷預(yù)后較為困難。鑒于此，目前對其分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究愈來愈多，如p53、p21、Ki67、bcl?鄄2等。已有多篇文獻(xiàn)報道分析了相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)記物與泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤的病理分級、臨床分期、復(fù)發(fā)及生存率的關(guān)系，為診斷腫瘤、制定正確的治療方案及判斷預(yù)后等提供重要的信息，本文就目前已報道的分子生物學(xué)標(biāo)記物作一綜述。

1　癌基因與抑癌基因

1.1　p53

p53的突變或丟失在膀胱癌的檢出率為50％～60％，Migaldi等[1]分析不同年齡膀胱癌患者的p53表達(dá)，發(fā)現(xiàn)p53異常表達(dá)在小于45歲的膀胱癌患者更為常見。大量研究表明，p53的改變與膀胱癌的分期、分級、侵襲性有關(guān)，但其是否與膀胱癌的復(fù)發(fā)及生存率相關(guān)仍有爭議。Yeniyol等[2]采用免疫組化檢測48例膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本中p53的表達(dá)，p53異常表達(dá)在不同臨床分期和病理分級間差異顯著，但未發(fā)現(xiàn)p53陽性組與陰性組腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率有明顯差異。Stavropoulos（n＝58）和Ong（n＝64）等[3]也得出類似的結(jié)論。但另有多篇文獻(xiàn)報道，p53與膀胱癌的復(fù)發(fā)率和死亡率顯著相關(guān)。Sanchez等[4]報道復(fù)發(fā)的膀胱癌（n＝47）p53的異常表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)者，p53的異常表達(dá)與膀胱癌的進(jìn)展和生存率相關(guān)。Wolf等報道p53異常表達(dá)與pT1G3膀胱癌（n＝30）的預(yù)后關(guān)系密切。

p53突變可能與膀胱原位癌（CIS）的生物學(xué)行為有關(guān)，導(dǎo)致CIS的侵襲性增加，Shariat等[5]檢測47例膀胱CIS的p53及其中39例標(biāo)本的p21表達(dá)，p53/p21聯(lián)合分析顯示出與腫瘤的復(fù)發(fā)、進(jìn)展及生存率之間密切的相關(guān)性，p53（+）/p21（+）患者腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展和死亡的危險程度遠(yuǎn)大于p53（+）/p21（-）或p53（－）/p21（－）者。

1.2　p21

關(guān)于p21與膀胱癌的報道結(jié)果并不統(tǒng)一，Chatterjee等[6]檢測p53、p21、pRb在164例TCC標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示p53、p21、pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)率和5年生存率的獨立因子，三者聯(lián)合分析顯示出與TCC預(yù)后之間良好的相關(guān)性。Kuczyk MA等也認(rèn)為p21WAF/CIP1可以作為判斷膀胱癌生存率的獨立預(yù)后因子。Liukkonen等[7]檢測207例膀胱癌(pTa～pT1)標(biāo)本中p21WAF1/CIP1和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)，平均隨訪4.9年，分析其與腫瘤分期、分級、細(xì)胞增殖率（MIB?鄄1指數(shù)）、p53、bcl?鄄2、生存率的關(guān)系。結(jié)果只有MIB?鄄1指數(shù)與無瘤生存率顯著相關(guān)（P=0.03），腫瘤復(fù)發(fā)率只與腫瘤分級（P=0.002）和細(xì)胞周期素D1的表達(dá)相關(guān)（P=0.04），提示p21WAF1/CIP1與其他因子相比預(yù)后作用較小，有關(guān)p21WAF1/CIP1在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義有待進(jìn)一步闡明。

1.3　p16 /CDKN2A

Hitchings等[8]檢測78例TCC 標(biāo)本（pTa～pT1） p53、p16、pRb的表達(dá)，多因素分析顯示任何兩者的改變與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，p53和 p16同時表達(dá)異常者腫瘤的進(jìn)展可能性增加14.45 倍，提示p53和 p16可用來判斷pTa～pT1期膀胱腫瘤的進(jìn)展情況。Benedict等發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)本中p16/CDKN2A的表達(dá)與Rb的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Rb強(qiáng)染色的標(biāo)本罕見p16陽性染色，同時，伴染色體9p21的雜合丟失的腫瘤p16/CDKN2A失表達(dá)，Rb強(qiáng)表達(dá)。Primdahl等發(fā)現(xiàn)初診即為浸潤型膀胱癌p16/CDKN2A的表達(dá)顯著低于繼發(fā)于Ta 或T1的浸潤期腫瘤，有關(guān)進(jìn)一步解釋尚待研究。

1.4　Rb

Sanchez Zalabardo D等[4]隨訪47例浸潤型膀胱癌患者，發(fā)現(xiàn)Rb表達(dá)異常的患者腫瘤進(jìn)展速度、復(fù)發(fā)率顯著升高。Sunanda等檢測164例TCC標(biāo)本pRb的表達(dá)，得出結(jié)論pRb可作為判斷TCC復(fù)發(fā)和生存率的獨立預(yù)后因子。另有報道對45例T1期膀胱腫瘤患者隨訪發(fā)現(xiàn)Rb基因的丟失與pRb的異常表達(dá)明顯導(dǎo)致患者無瘤生存率降低，此外，多篇文獻(xiàn)報道Rb在與p21、p16、Ki67、p53等聯(lián)合判斷膀胱癌預(yù)后時表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，可作為較理想預(yù)后因子。

2　細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)

細(xì)胞核相關(guān)抗原（Ki67）是增殖性細(xì)胞核的標(biāo)記物，可通過單克隆抗體MIB?鄄1檢測，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的重要意義被越來越多的作者證實。Migaldi等發(fā)現(xiàn)老年患者膀胱癌標(biāo)本MIB?鄄1指數(shù)高于年輕者，并且與膀胱癌復(fù)發(fā)率、生存率密切相關(guān)[9]。Nakopoulou等(n=94)、Saika等（n=203）、Santos等（n＝159）也研究發(fā)現(xiàn)Ki67是膀胱癌良好的獨立預(yù)后因子。

Frank等[10]選取伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的尿道膀胱腫瘤139例，手術(shù)切除腫瘤并行化療，隨訪分析p53和MIB?鄄1在判斷腫瘤預(yù)后及化療療效中的作用，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)p53和MIB?鄄1與該類腫瘤患者的預(yù)后具有顯著性相關(guān)，但MIB?鄄1指數(shù)與腫瘤的化療療效呈顯著負(fù)相關(guān)，提示MIB?鄄1可以作為判斷膀胱癌化療療效的指標(biāo)，指導(dǎo)臨床治療。同樣，Matsumoto等對62例膀胱移行細(xì)胞癌（pT1G3～pT4M0）標(biāo)本進(jìn)行類似研究，平均隨訪34個月，發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)與腫瘤化療完全緩解率顯著性相關(guān)，能較好地判斷療效。

3　細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)

3.1　bcl?鄄2/bax

bcl?鄄2被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡的重要的原癌基因。bcl?鄄2、bax屬于凋亡調(diào)控基因bcl?鄄2 基因家族， 分別能夠阻遏和促進(jìn)凋亡， bax?鄄bax同源二聚體促進(jìn)凋亡，bcl?鄄2?鄄bax異聚體阻遏凋亡，突變的p53蛋白可起到與bcl?鄄2蛋白類似的作用，并抑制bax基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制凋亡。

Uchida T等觀察到119例膀胱癌患者中p53的表達(dá)與腫瘤分期分級相關(guān)，bcl?鄄2表達(dá)與腫瘤臨床病理特征無關(guān)，但p53和bcl?鄄2同時過表達(dá)提示不良預(yù)后[11]。Wolf、Gazzaniga等也證實bcl?鄄2的表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)率和無瘤生存率明顯相關(guān)。但 Asci R等[12]報道年齡小于40歲患者TCC細(xì)胞漿bcl?鄄2和p53的表達(dá)分別為54%、37%，與腫瘤的進(jìn)展無明顯相關(guān)。同樣，F(xiàn)raile、Stavropoulos等報道bcl?鄄2的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級及復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示有關(guān)bcl?鄄2的作用仍需進(jìn)一步研究。

3.2　Fas/FasL

Fas與FasL都是跨膜蛋白，分別屬于TNF受體和TNF家族，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化可導(dǎo)致細(xì)胞表面FasL被激活，與Fas結(jié)合，使表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lee SH等檢測37例膀胱癌標(biāo)本，F(xiàn)as/FasL的高表達(dá)達(dá)到92％。Lee等報道43例膀胱腫瘤標(biāo)本28％有Fas基因的突變。目前對血液中可溶性Fas (sFas)和可溶性FasL (sFasL)研究較多，Mizutani等[13]報道sFas或sFasL的升高預(yù)示Ta期膀胱癌患者早期復(fù)發(fā)的可能，sFas或sFasL可作為判斷Ta期膀胱癌復(fù)況的預(yù)后因子。

4　血管形成因子

4.1　VEGF

與大多數(shù)實體瘤一樣，膀胱癌的形成也具有血管形成依賴性，與血管內(nèi)皮生長因子VEGF關(guān)系密切。Vasilios等[14]研究VEGF和低氧誘導(dǎo)因子(HIF?鄄1α)之間的關(guān)系及兩者在TCC中的預(yù)后意義，結(jié)果顯示HIF?鄄1α與腫瘤病理分級顯著相關(guān)，VEGF和微血管密度（MVD）與腫瘤分級和臨床分期顯著相關(guān)。HIF?鄄1α與VEGF和MVD顯著相關(guān)，提示VEGF和HIF?鄄1α的升高刺激血管生成，導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良。同樣，Santos（n＝66）也報道VEGF可作為判斷膀胱上皮腫瘤的預(yù)后因子。

4.2　血栓黏合素?鄄1

血栓黏合素?鄄1(TSP?鄄1) 是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，分子量為430kD。TSP?鄄1被認(rèn)為是惟一抑制腫瘤血管形成的物質(zhì)。Grossfeld等[15]分析了163例TCC標(biāo)本TSP?鄄1、p53的表達(dá)與TCC復(fù)發(fā)生存率之間的關(guān)系，TSP?鄄1表達(dá)與TCC復(fù)發(fā) （P=0.009）和生存率（P=0.023) 顯著相關(guān)，低表達(dá)TSP?鄄1患者腫瘤復(fù)發(fā)率增高，生存率降低。

5　生長因子及受體

5.1　EGFR

EGFR在眾多上皮腫瘤中有較高的陽性表達(dá)，Colquhoun等[16]綜述了近年來有關(guān)EGFR與膀胱癌的研究，得出結(jié)論EGFR的表達(dá)與膀胱癌的分期、分級、復(fù)發(fā)率、無瘤生存率明顯相關(guān)，EGFR過表達(dá)提示腫瘤預(yù)后不佳，使用抑制EGFR活性的物質(zhì)如ZD 1839等可望成為臨床治療膀胱癌等的新手段。

5.2　TGFα

TGFα在膀胱癌中的表達(dá)顯著高于正常膀胱組織，Ravery等報道43例膀胱癌中60％存在TGFα高表達(dá)，且與腫瘤死亡率顯著相關(guān)。Ravery等分析28例早期膀胱腫瘤TGFα?鄄mRNA的表達(dá)，隨訪兩年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤復(fù)發(fā)顯著相關(guān)，對判斷早期膀胱腫瘤的預(yù)后有重要價值。Thogersen等則報道TGFα與EGFR的表達(dá)相關(guān)，但與患者生存率無明顯相關(guān)，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的作用有待研究。

6　細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞黏附分子

6.1　MMPs

Hara等[17]分析51例表淺TCC中MMP?鄄2、MMP?鄄9、膜型MMP?鄄1 (MT1?鄄MMP)與腫瘤復(fù)發(fā)率間的關(guān)系，復(fù)發(fā)組MMP?鄄9的表達(dá)是未復(fù)發(fā)組的2.5倍，未發(fā)現(xiàn)MMP?鄄2、MT1?鄄MMP表達(dá)的差異，MMP?鄄9高表達(dá)組無瘤生存率顯著低于正常表達(dá)組。同樣，Ozdemir等檢測60例膀胱癌MMP?鄄1，MMP?鄄2，MMP?鄄9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有MMP?鄄9的表達(dá)與腫瘤的分期分級相關(guān)。Papathoma等報道隨著尿路上皮腫瘤分級和浸潤程度的升高，MMP?鄄9和MMP?鄄2表達(dá)顯著升高，但兩者與腫瘤的復(fù)發(fā)率無明顯相關(guān)，提示其在判斷膀胱癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的意義仍有待研究。

6.2　E?鄄鈣黏蛋白

E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)與腫瘤分化、癌細(xì)胞侵襲能力及轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。Shahrokh等檢測53例膀胱CIS標(biāo)本E?鄄鈣黏蛋白的表達(dá)，隨訪131個月，多因素分析表明E?鄄鈣黏蛋白是與CIS復(fù)發(fā)、進(jìn)展、無瘤生存率顯著相關(guān)的獨立因素，提示E?鄄鈣黏蛋白異常表達(dá)的腫瘤侵襲性高，需要早期徹底治療。Rao等分析細(xì)胞支架蛋白－肌動蛋白（Gelsolin）和E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義，結(jié)果示Gelsolin與膀胱癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)E?鄄鈣黏蛋白在判斷膀胱癌預(yù)后中的顯著意義，其在判斷膀胱癌預(yù)后中的意義還有待明確。

與臨床病理學(xué)相比，腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記為腫瘤生物學(xué)行為的分析、治療方式的選擇、臨床預(yù)后的判斷提供了更客觀、更豐富的信息，深入研究此類標(biāo)記十分必要。目前對泌尿系統(tǒng)上皮腫瘤分子生物學(xué)標(biāo)記物的研究雖已取得進(jìn)展，但除了對個別標(biāo)記物Rb、Ki67的意見較為統(tǒng)一外，對絕大多數(shù)標(biāo)記物在腫瘤中的表達(dá)分布及預(yù)后價值仍存在爭議，目前的文獻(xiàn)報道多存在樣本量小的問題，缺少大規(guī)模研究的支持，再加上免疫組化法檢測蛋白受抗體選擇、陽性結(jié)果判斷、手工操作等外在因素影響的問題，導(dǎo)致研究結(jié)果之間缺乏可比性或?qū)ν愌芯繉ο蟮贸鱿喾吹慕Y(jié)論，因此需要將實驗方法標(biāo)準(zhǔn)化以提高研究的可靠性和可重復(fù)性。此外，由于腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是涉及多種分子機(jī)制的極其復(fù)雜的過程，僅憑對單一預(yù)后指標(biāo)的評估不能全面準(zhǔn)確地反映腫瘤的惡性潛能，腫瘤免疫標(biāo)記物最終的臨床應(yīng)用可能是多個指標(biāo)的綜合評估。

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篇5

[關(guān)鍵詞] 分化型甲狀腺癌；分子生物學(xué)；進(jìn)展

[中圖分類號] R736.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）09（b）-0019-03

甲狀腺癌主要組織病理學(xué)類型包括狀癌（PTC）、濾泡狀癌（FTC）、髓樣癌（MTC）以及未分化癌（ATC）。前兩者統(tǒng)稱分化型甲狀腺癌（DTC），共占甲狀腺癌的90%以上，占頭頸部惡性腫瘤的首位，占所有惡性腫瘤的3%，女性發(fā)病率較高。近20年來，我國甲狀腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，由約1/10萬上升到（3～4）/10萬。DTC確切的致病因素尚不清楚，幼年時過量射線照射是目前唯一確定的致癌機(jī)制[1-2]。近年來分子生物學(xué)技術(shù)研究使人們對甲狀腺癌的分子機(jī)制有了更深入的了解，這對于指導(dǎo)甲狀腺癌的診斷治療及療效評價有非常重要的意義，本文就DTC相關(guān)基因研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BRAF基因

BRAF基因最早是在人類尤文肉瘤中發(fā)現(xiàn)的高度表達(dá)變異的癌基因，在極少數(shù)的胃腸癌、肺癌、卵巢癌以及甲狀腺癌等多種腫瘤中都有表達(dá)[3]。BRAF又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，該基因位于第7號染色體，為RAF基因家族成員之一，是RET和RAS的下游信號分子。目前認(rèn)為，BRAF基因突變是甲狀腺癌最常見的基因變異之一，約49%的PTC和25%的ATC會出現(xiàn)該基因的表達(dá)[4]。其發(fā)生機(jī)制為BRAF基因錯義突變的15外顯子堿基，致使翻譯蛋白質(zhì)600位密碼子將對應(yīng)的纈氨酸 （V600E）替代為谷氨酸，可活化蛋白激酶，并進(jìn)一步激活ERK激酶，向MAPK信號通路下游傳遞細(xì)胞有絲分裂信號，致使甲狀腺細(xì)胞腫瘤形成并向惡性轉(zhuǎn)化[5]。

BRAF基因突變是近年來甲狀腺癌基因領(lǐng)域的重要研究進(jìn)展，也是目前針對DTC發(fā)生機(jī)制研究最多的突變類型之一。最近研究顯示導(dǎo)致激酶激活突變的因素有多種，包括點突變框內(nèi)插入或框內(nèi)缺失、放射線暴露等，盡管其發(fā)生率較低。由于BRAF基因突變在DTC中發(fā)生率較高，而在甲狀腺良性病變中檢測不到，因此該突變可以作為特異性較強(qiáng)的DTC診斷指標(biāo)。該突變與低分化的甲狀腺癌及ATC的變異性也有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，在高細(xì)胞及經(jīng)典亞型的PTC中更為常見。還有研究顯示該突變的存在似乎與腫瘤的侵襲性特征有關(guān)，此突變可使腫瘤更易去分化，因為此突變可見于間變性轉(zhuǎn)化，如甲狀腺包膜外侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤復(fù)發(fā)，而這類因素往往代表著較高的腫瘤相關(guān)死亡率。一些大樣本臨床研究證實，腺體外浸潤、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期（Ⅲ/Ⅳ期）均與BRAF突變呈正相關(guān)[6]。有研究對PTC患者隨訪顯示高達(dá)80%～85%的復(fù)發(fā)PTC伴有BRAF突變，這證明對于PTC復(fù)發(fā)，BRAF突變有很強(qiáng)的預(yù)測作用。

以BRAF以及其下游激酶為靶點的分子靶向藥物治療已成為目前DTC治療研究的又一熱點。近年來研究顯示多靶點激酶抑制劑索拉非尼（sorafenib）能抑制BRAF突變基因型的甲狀腺腫瘤細(xì)胞和甲癌腫瘤模型的增殖和生長，但目前國內(nèi)尚未見該藥用于甲狀腺癌治療的報道[7]。

2 RET/PTC重排基因

RET基因于1985年首次發(fā)現(xiàn)于小鼠轉(zhuǎn)化的NIH3T3細(xì)胞中，因其同樣具有與其他基因重排及活化的特征，故又稱為RET原癌基因。RET原癌基因經(jīng)重排后被稱為RET/PTC癌基因，屬于酪氨酸蛋白激酶受體家族。在這些RET/PTC重排中，RET基因的跨膜區(qū)和細(xì)胞外區(qū)丟失，取而代之的是不同基因來源的5′末端，例如RET與H4融合形成RET/PTC1嵌合體，與RIalpha融合形成RET/PTC2嵌合體等。其產(chǎn)生的嵌合體使RET原癌基因編碼的酪氨酸蛋白激酶發(fā)生激活，通過下游信號的傳導(dǎo)使甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[8]。目前研究指出，甲狀腺的免疫功能通過RET/PTC1下調(diào)，可間接促進(jìn)PTC的發(fā)生。提示癌基因、免疫、炎癥及惡性腫瘤生物學(xué)特性之間存在一定聯(lián)系，在甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制中RET/PTC基因重排有較重要的作用。

在PTC細(xì)胞中RET/PTC基因重排普遍存在，而在正常甲狀腺組織及良性甲狀腺病變中不表達(dá)或基本不表達(dá)[9]，所以RET/PTC重排可以作為診斷PTC較特異的指標(biāo)。但PTC中RET/PTC的表達(dá)率報道不一，所以其陰性結(jié)果并不能完全除外PTC。此外，國外研究還發(fā)現(xiàn)放射性暴露史能引起RET/PTC基因重排并進(jìn)一步促使甲狀腺癌的發(fā)生。國外學(xué)者報道幼年時曾有放射線暴露史的PTC患者的RET/PTC重排發(fā)生率明顯高于無此經(jīng)歷的PTC患者[10]。還有作者對在切爾諾貝利核泄露事故中受過量射線照射所致的狀甲狀腺癌患者進(jìn)行分子生物學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)上述特點。

對于有無RET/PTC重排及與PTC的臨床特征之間的關(guān)系，目前臨床認(rèn)為存在RET/PTC重排的PTC患者的TNM分期更晚，也更易表現(xiàn)出甲狀腺被膜外侵犯，也更易復(fù)發(fā)。但由于采集病例數(shù)較少以及所采用的免疫方法不同，在不同的國家和地區(qū)，其陽性率相差也比較大，為2.5%～53.5%。還有證據(jù)顯示是否存在RET/PTC重排與甲狀腺狀癌的不同生物學(xué)行為特點有關(guān)，有RET/PTC2重排的分化型甲狀腺癌往往具有高度的侵襲性和去分化能力[11]。國外Zafon等[12]報道 RET/PTC表達(dá)陽性的甲狀腺狀癌患者更易發(fā)生局部浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P

舒尼替尼（sunitinib）為近年研制的一種多靶點受體拮抗劑，可以明顯抑制RET/PTC酪氨酸激酶[13]。在另一項研究中，舒尼替尼可抑制具有RET/PTC1重組的PTC增殖和生長，但目前國內(nèi)亦尚未用于甲狀腺癌的臨床治療。

3 RAS原癌基因

RAS是一種原癌基因，廣泛存在于人和動物細(xì)胞中，為人類多種腫瘤最常見的基因異常。RAS基因包括K-RAS、H-RAS和N-RAS 3種類型，這三種基因內(nèi)結(jié)構(gòu)分別很大，但都編碼一種結(jié)構(gòu)相似的G蛋白質(zhì)，分子量為21 kD，故統(tǒng)稱為P21-RAS[14]。分子生物學(xué)及遺傳學(xué)研究提示，RAS基因是存在于細(xì)胞膜上一種鳥嘌呤核苷酸的結(jié)合蛋白，為多種酪氨酸激酶受體的感受器，并細(xì)胞的生長及分化起調(diào)解作用。該基因一般有兩種存在方式，即與GDP結(jié)合時的失活狀態(tài)以及與GTP結(jié)合時的活化狀態(tài)。突變的RAS蛋白降低了自身內(nèi)源性鳥苷酸三磷酸酶（GTP）的活性，其結(jié)果是致使GTP與RAS蛋白的持續(xù)結(jié)合并具有了促使細(xì)胞生長的作用，致使RAS處于一種持續(xù)激活的狀態(tài)中。由于酪氨酸激酶受體等多種信號傳導(dǎo)通道的傳感器都受該基因編碼聯(lián)系，并可激活多個不同信號傳導(dǎo)通道，其結(jié)局會導(dǎo)致甲狀腺組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性。

RAS突變常在特定腫瘤中出現(xiàn)，如RAS突變可見于95%的胰腺癌中。它也是DTC中檢測到的最常見的突變之一。不同的腫瘤有不同的RAS基因突變類型，如K-RAS突變與肺癌有關(guān)等。DTC中已經(jīng)檢測到多種RAS基因突變?nèi)鏝-RAS、K-RAS、H-RAS，但在MTC組織中幾乎從未檢測出該基因突變。該基因突變主要存在于濾泡型PTC及濾泡性腺瘤中，但FTC少見[15-16]，該基因突變還對濾泡性腺瘤能否進(jìn)一步發(fā)展為腺癌或者未分化癌具有一定的預(yù)測意義，為RAS陽性的腺瘤積極手術(shù)切除提供依據(jù)。大約10%的FTC可見RAS基因的點突變，并且似乎僅與濾泡亞型FTC有關(guān)。RAS點突變型FTC往往伴有濾泡變異型組織學(xué)的特性，表現(xiàn)為腫瘤外侵、腫瘤的失分化和出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，這在存在骨轉(zhuǎn)移的病例中表現(xiàn)尤為明顯[17]。而在低分化DTC組織中往往RAS突變檢出率較高，表明該突變會導(dǎo)致DTC更強(qiáng)的侵襲能力。

RAS突變是在DTC中比較多見的事件，具有較高的特異性和敏感性。RAS突變和這些腫瘤的預(yù)后及臨床特征密切相關(guān)，作為一種DTC的診斷學(xué)標(biāo)志具有較廣闊的發(fā)展前景。RAS抑制劑洛伐他汀已被證實在RAS突變的的甲狀腺腫瘤的體內(nèi)具有抗腫瘤效果[18]，為RAS突變表達(dá)的DTC提供了新的治療方法，可能對限制腫瘤的播散有作用，這還需要臨床進(jìn)一步研究。

綜上所述，多種免疫組化結(jié)果與DTC的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系，而且，每種基因的作用均有所不同。甲狀腺標(biāo)本檢測P21-RAS有助于分化型甲狀腺癌的診斷，而進(jìn)行RET/PTC及BRAF檢測，不但可以有助于診斷PTC，而且可更好地估計腫瘤的侵襲性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移特點，對于腫瘤的后續(xù)治療方案（如分子靶向治療等）及判斷預(yù)后有重要價值。

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